О ЖУРНАЛЕ

НОВОСТИ

АВТОРАМ

КОНТАКТЫ

ENGLISH

Идентификация фильтрующихся форм бактерий планктона озера Байкал с помощью высокопроизводительного секвенирования

Identification of filterable forms of plankton bacteria in Lake Baikal using high-throughput sequencing

Ласточкина Е.Е.^1,2, Липко И.А.¹, Тихонова И.В.¹, Краснопеев А.Ю.¹, Потапов С.А.¹, Белых О.И.¹

Elizaveta E. Lastochkina^1,2, Irina A. Lipko¹, Irina V. Tikhonova¹,
Andrey Yu. Krasnopeev¹, Sergey A. Potapov¹, Olga I. Belykh¹

¹Лимнологический институт СО РАН (Иркутск, Россия)
²Иркутский государственный университет (Иркутск, Россия)

¹Limnological Institute of SB RAS (Irkutsk, Russia)
²Irkutsk State University (Irkutsk, Russia)

УДК 582.26+577.21

На данный момент культивирование ультрамикробактерий весьма затруднительно, и только благодаря методам молекулярной биологии возможна идентификация данных бактерий. В нашем исследовании была определена таксономическая структура микробного сообщества в центральной точке пролива Малое море озера Байкал (на глубине 0-50 м). Доминирующими филами оказались во фракции бактериопланктона, собранной на фильтр с диаметром пор 0,2 мкмк, являлись Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteriota и Armatimonadota, фильтрующимися формами, проходящими бактериальные фильтры, являются представители Actinobacteriota и Proteobacteria. Для дальнейшего изучения ультрамелких форм бактерий нужно исследовать их геномы.

Ключевые слова: бактериопланктон; озеро Байкал; фильтрующиеся формы бактерий; высокопроизводительное секвенирование.

At the moment, the cultivation of ultramicrobacteria is very difficult, and the identification is possiblewith molecular methods. In our study, the taxonomic structure of the microbial community was determined in the central point of the Maloye More Strait of Lake Baikal (at a depth of 0-50 m). The dominant phylums were Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteriota, and Armatimonadota in the bacterioplankton fraction collected on a filter with a pore diameter of 0.2 μm; representatives of Actinobacteriota and Proteobacteria are filterable forms passing through bacterial filters. To understand the physiology of ultra-small bacteria, it is necessary to study their genomes.

Keywords: bacterioplankton; Lake Baikal; filterable forms of bacteria; high-throughput sequencing.

Недавние исследования показали, что ультрамелкие формы бактерий являются весьма значительным компонентом многих сообществ (обзор Nakai, 2020). Эти организмы представляют большой интерес – во-первых, мелкие размеры позволяют им преодолевать системы фильтрации, применяющиеся при стерилизации пищевых и медицинских жидкостей и представлять собой опасность контаминации. Во-вторых, способность образовывать ультрамелкие клетки считается одной из стратегий выживания в экстремальных условиях (Дмитриев и др., 2004; Дуда и др., 2012), а фитопатогенные микоплазмы при этом становятся и более инвазивными (Чернов и др., 2007; Музыкантов, 2008). Биология таких мелких объектов является уникальной и интересна с точки зрения фундаментальной науки. Термин «ультрамикробактерии» предложен в 1981 году (Torrella, Morita, 1981) для описания мелкого морского бактериопланктона. Получение культур бактерий Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas и Alcaligenes после фильтрации через фильтры 0,2 мкм дало предположение, что через фильтр также проходят покоящиеся клетки обычных бактерий. Клетки таких микроорганизмов не являются ультрамикробактериями, объем клеток которых менее 0,1 мкм³, и при попадании в благоприятные условия делятся с образованием более крупных клеток. В России исследования ультрамикробактерий и фильтрующихся форм клеток ведутся с 2000 годов, они обнаружены в вечной мерзлоте, почвах, нефтешламе и илах, планктоне водохранилищ и ацидных озер (Дмитриев и др., 2001; Лысак и др., 2010; Сузина и др., 2011; Федотова и др., 2012, 2013). Впервые метагеномный анализ для исследования ультрамикробактерий и фильтрующихся форм был проведен для почв Антарктиды (Кудинова и др., 2020). Цель нашей работы - исследовать фракцию бактерий из озера Байкал, способных проходить через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм с помощью метагеномного секвенирования ампликонов 16S рРНК гена.

Пробы воды были собраны в августе 2020 года в центральной точке пролива Малое море озера Байкал. Воду отбирали с глубин 0,5, 10, 15, 25, 50, смешивали в равных пропорциях и осуществляли префильтрацию через полиэфирсульфоновые мембраны с диаметром пор 0,22 мкм (Реатрек, Россия), с последующим осаждением ультрамелких бактерий на мембраны с диаметром пор 0,05 мкм (Millipore, США). Для сравнения исследовали состав бактерий, сконцентрированных на 0,2 мкм фильтре и собранных на фильтр с диаметром пор 0,05 мкм после фильтрации 0,2 мкм. ДНК из полученного материала выделяли с помощью ферментативного лизиса с последующей экстракцией фенол-хлороформом. Очищенную ДНК использовали в качестве матрицы для метагеномного анализа фрагмента гена 16S рРНК с праймерами 341F (CTCCTACGGRRSGCAG) и 806RB (GGACTACNVGGGTWTCTAAT). Секвенирование выполнено в компании Евроген (Москва) с помощью MiSeq (Illumina, USA). Метагеномные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения DADA2 (параметры: maxN = 0, maxEE = c (2,4), включая выравнивание, фильтрацию химер, короткие и ложные последовательности и кластеризацию точных вариантов последовательностей (ESV) (Callahan et al., 2016). Фрагменты гена 16S рРНК выровнены и таксономически отнесены с использованием базы данных SILVA v.138.1 с доверительным порогом 80% (Quast et al., 2013) и сгруппированы в точные варианты уникальных последовательностей (ESV) на расстоянии 0,03 мкм с помощью mothur v.1.45.0 (Schloss et al., 2009). При неопределенной систематике микроорганизма осуществляли дополнительный поиск данных с помощью BLAST-анализа (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Во фракции более 0.2 мкм присутствовало около 60 филотипов бактерий, среди которых доминировали Cyanobacteria (Cyanobium), Proteobacteria (Caulobacter, Brevundimonas, Sphingorhabdus, Rhodobacter, Phenylobacterium (Roseomonas)), Actinobacteriota (некультивируемые групп hgcl, CL500-29 marine group и филы Candidatus_Planktophila), Armatimonadota (Armatimonas). Это характерные для пресноводных водоемов филы, в Байкале они уже описаны (Mikhailov et al., 2021). Фракция планктона после 0,2 мкм отличалась по составу, основными доминантами были некультивируемые Actinobacteriota, genus CL500-29_marine_group и hgcI_clade. Актинобактерии одна из доминирующих фил среди пресноводных бактерий, наши исследования показали, что они же и самые многочисленные среди ультрамикропланктонной фракции озера Байкал. Предполагают, что маленький объем клеток и тонкие клеточные стенки у актинобактерий являются своеобразной адаптацией к планктонному образу жизни в толще пресных водоемов (Hahn, 2009), а также защитным приспособлением от выедания протозойным планктоном (Salcher, 2014). Ближайшими гомологами байкальских ультрамикробактерий являются: Actinobacteria bacterium strain IMCC27063, Actinobacterium SCGC AAA278-P20, Actinobacterium SCGC AAA028-N15, Actinobacterium SCGC AAA044-C20, Actinobacterium SCGC AAA044-D11, Actinobacterium SCGC AAA278-P22. Самая многочисленная группа с вариантами последовательностей ESV0016 и ESV0008 относится к актинобактериям группы hgcI, которая представлена некультивируемыми бактериями и была описана с помощью молекулярно-биологических методов. Данные пресноводные обитатели имеют малый размер клеток, уменьшенные геномы (от 1,16 до 1,48 мегабаз), множественные ауксотрофии, потребность в восстановленных соединениях серы, имеют родопсины (Mondav et al., 2020). Ближайшими гомологами байкальских видов являются Candidatus Nanopelagicus hibericus isolate и Candidatus Nanopelagicus limnes isolate.

Вторая группа последовательностей (ESV0006, ESV0015, ESV0019, ESV0025) принадлежала также группе hgcI_clade, но другим представителям – роду Candidatus Planktophila. Культуры этого рода были получены и описаны морфологически и генетически, они обладают клетками с размером 0,4–0,5 мкм и средней длиной 1,2 мкм, со слегка С-образной морфологией (Jezbera et al., 2009). Последовательности ESV0007 и ESV0010) относятся к актинобактериям hgcI, ближайшими гомологами являются Candidatus Planktophila vernalis и Candidatus Planktophila versatilis. Последовательность ESV0005 принадлежит Proteobacteria, ближайший родственник Candidatus Fonsibacter ubiquis. Имеют самый маленький закрытый геном, о котором до сих пор сообщалось для штамма SAR11 (1,16 мегабаз) (Henson, 2018). Последовательность ESV0047 принадлежит протеобактериям рода Caulobacter. Это крупные формы бактерий, в Байкале они уже были описаны ранее (Ковадло, Дрюккер, 2006). Они известны своим полиморфизмом в ответ на разное содержание питательных веществ в среде обитания. Ближайшим гомологом является Caulobacter henricii strain 4ABL27. Мы предполагаем, что байкальская бактерия Caulobacter sp., обнаруженная с помощью высокопроизводительного секвенирования, не является истинной ультрамикробаткерией, а образует фильтрующиеся формы, которые попадают в ультрамикропланктон. Последовательности ESV0031, ESV0058 принадлежат порядку некультивируемых Saccharimonadia, которые играют определенную роль в деградации различных органических соединений, а также соединений сахара в аэробных, нитратредуцирующих и анаэробных условиях. Экология их разнообразна, они обнаружены в пресных водах и в ротовой полости млекопитающих (Kindaichi et al., 2016). Нами обнаружены последовательности байкальских ультрамикробактерий филума Chloroflexi (ESV0063). Это так называемая морская группа SL56. Однако этот кластер постоянно встречается только в озерах, водохранилищах и реках, что позволяет предположить, что он не только морской ( Mehrshad et al., 2018).

Таким образом, во фракции ультрамикропланктона озера Байкал основным компонентом являлись Actinobacteriota и Proteobacteria. Однако для более полной их характеристики необходимо получение чистых культур ульрамикробактерий и исследование их геномов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Работа подготовлена в рамках государственного задания ЛИН СО РАН, темы № 0279-2021-0015.

Список литературы

Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.И., Боронин А.М. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах // Микробиология. 2004. T. 73 №6. С. 832–840.
Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Русакова Т.Г., Гиличинский Д.А., Дуда В.И. Ультраструктурные особенности природных форм микроорганизмов, изолированных из грунтов вечной мерзлоты Восточной Сибири методом низкотемпературного фракционирования // Докл. РАН. 2001. Т. 378, №6. С. 846–849.
Дуда В.И., Сузина Н.Е., Поливцева В.Н., Боронин А.М. Ультрамикробактерии: становление концепции и вклад ультрамикробактерий в биологию // Микробиология. 2012. Т. 81, №4. С. 415–427.
Ковадло А.С., Дрюккер В.В. Распространение бактерий рода Caulobacter (Henrici and Johnson, 1935) в озере Байкал // Cиб. экол. журн. 2006. №5. С. 581–585.
Кудинова А.Г., Петрова М.А., Долгих А.В., Соина В.С., Лысак Л.В., Маслова О.А. Таксономическое разнообразие бактерий и их фильтрующихся форм в почвах Восточной Антарктиды (оазисы Холмы Ларсеманн и Холмы Бангера) // Микробиология. 2020. T. 89, №5. С. 581–592.
Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А., Звягинцев Д.Г. Численность и таксономический состав ультрамикробактерий в почвах // Микробиология. 2010. Т. 79, №3. С. 428–432.
Музыкантов А.А. Адаптация микоплазм (Mycoplasma Gallisepticum S6) к неблагоприятным условиям: Автореф. дис. канд. биол. наук – Казань, 2008. – 20 с.
Сузина Н.Е., Дуда В.И., Есикова Т.З., Шорохова А.П., Гафаров А.Б., Олейников Р.Р., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Поливцева В.Н., Боронин А.М. Новые ультрамикробактерии из рода Chryseobacterium, штаммы NF4 и NF5 - факультативные эпибионты Bacillus subtilis // Микробиология. 2011. Т. 80, №4. С. 529–542.
Федотова А.В., Белова С.Э., Куличевская И.С., Дедыш С.Н. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей в воде ацидных озер Севера России // Микробиология. 2012. Т. 81, №3. С. 281–287.
Чернов В.М., Мухаметшина Н.Е., Гоголев Ю.В., Нестерова Т.Н., Чернова О.А. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста: нанотрансформация и фитопатогенность Acholeplasma laidlawii PG8 // ДАН. 2007. Т. 413, №2. С. 271–275.
Callahan B.J., McMurdie P.J., Rosen M.J., Han A.W., Johnson A.J., Holmes S.P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data // Nat. Methods. 2016. V. 13. P. 581–583.
Fedotova A.V. Serkebaeva Y.M., Sorokin V.V., Dedysh S.N. Filterable microbial forms in the Rybinsk water reservoir // Microbiology (Mikrobiologiya). 2013. V. 82, No. 6. P. 728–734.
Hahn M.W. Description of seven candidate species affiliated with the phylum Actinobacteria, representing planktonic freshwater bacteria // Int J Syst Evol Microbiol. 2009. V. 59. P. 112–117.
Henson M.W., Lanclos V.C., Faircloth B.C., Thrash J.C. Cultivation and genomics of the first freshwater SAR11 (LD12) isolate // ISME J. 2018. V. 12. P. 1846–1860.
Jezbera J., Sharma A.K., Brandt U., W.F. Doolittle, Hahn M.W. ‘Candidatus Planktophila limnetica’, an actinobacterium representing one of the most numerically important taxa in freshwater bacterioplankton // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2009. V. 59. P. 2864–2869.
Kindaichi T., Yamaoka S., Uehara R., Ozaki N., Ohashi A., Albertsen M., Nielsen P.H, Nielsen J.L. Phylogenetic diversity and ecophysiology of Candidate phylum Saccharibacteria in activated sludge // FEMS Microbiology Ecology. 2016. V. 92, No. 6. P. fiw078,
Mehrshad M., Salcher M.M., Okazaki Y., Nakano S., Šimek K., Andrei A.-S., Ghai R. Hidden in plain sight-highly abundant and diverse planktonic freshwater Chloroflexi // Microbiome. 2018. V. 6. P. 176.
Mikhailov I.S., Galachyants Y.P., Bukin Y.S., Petrova D.P., Bashenkhaeva M.V., Sakirko M.V., Blinov V.V., Titova LA, Zakharova Y.R., Likhoshway Y.V. Seasonal Succession and Coherence Among Bacteria and Microeukaryotes in Lake Baikal. Microb Ecol. 2021. DOI: 10.1007/s00248-021-01860-2.
Mondav R., Bertilsson S., Buck M., Langenheder S., . Lindström E.S., Garcia S.L. Streamlined freshwater bacterioplankton Nanopelagicales (acI) and “Ca. Fonsibacter” (LD12) thrive in functional cohorts // DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.18.997650
Nakai R. Size Matters: Ultra-small and Filterable Microorganisms in the Environment // Microbes Environ. 2020. V. 35, No. 2. P. ME20025.
Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Peplies J., Glöckner F.O. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved dataprocessing and web-based tools // Nucleic Acids Research. 2013. V. 41. P. 590–596.
Salcher M.M. Same same but different: ecological niche partitioning of planktonic freshwater prokaryotes // J. Limnol. 2014. V. 73. P. 74–87.
Schloss P.D. Westcott S.L., Ryabin T., Hall J.R., Hartmann M., Hollister E.B., Lesniewski R.A., Oakley B.B., Parks D.H., Robinson C.J., Sahl J.W., Stres B., Thallinger G.G., Van Horn D.J., Weber C.F. Introducing mothur:open-source, platform-independent, community-supported software for describingand comparing microbial communities // ApplieD and Environmental Microbiology. 2009. V. 75(23). P. 7537–7541.
Torrella F., Morita R.Y. Microcultural study of bacterial size changes and microcolony and ultramicrocolony formation by heterotrophic bacteria in seawater // Appl. Env. Microbiol. 1981. V. 41. P. 518–527.

Доклад поступил в редакцию 08.12.2021

Об авторах

Ласточкина Елизавета Евгеньевна − Elizaveta E. Lastochkina

студент, Иркутский государственный университет, Иркутск, Россия (Irkutsk State University, Irkutsk, Russia), Биолого-почвенный факультет, лаборатория водной микробиологии; Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia)

liza.lastochkina.00@mail.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0003-0094-5007

Липко Ирина Анатольевна − Irina A. Lipko

кандидат биологических наук
научный сотрудник, Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia), лаборатория водной микробиологии

irinalipko@yandex.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-6214-2974

Тихонова Ирина Васильевна − Tikhonova Irina V.

кандидат биологических наук
старший научный сотрудник, Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia), лаборатория водной микробиологии

iren@lin.irk.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-4323-6799

Краснопеев Андрей Юрьевич − Krasnopeev Andrey Yu.

аспирант
младший научный сотрудник, Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia), лаборатория водной микробиологии

andrewkrasnopeev@gmail.com

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-3368-4678

Потапов Сергей Анатольевич − Potapov Sergey A.

ведущий инженер, Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia), лаборатория водной микробиологии

poet1988@list.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0003-1391-6731

Белых Ольга Ивановна − Belykh Olga I.

кандидат биологических наук
ведущий научный сотрудник, руководитель лаборатории водной микробиологии, Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия (Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia)

belykh@lin.irk.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-1188-7351

Корреспондентский адрес: Россия, 664033, Иркутск, ул. Улан-Баторская - 3, а/я 278, ЛИН СО РАН.

ССЫЛКА:

Ласточкина Е.Е., Липко И.А., Тихонова И.В., Краснопеев А.Ю., Потапов С.А., Белых О.И. Идентификация фильтрующихся форм бактерий планктона озера Байкал с помощью высокопроизводительного секвенирования // Материалы Международной дистанционной научно-практической конференции «Водные экосистемы в современном мире»

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

Identification of filterable forms of plankton bacteria in Lake Baikal using high-throughput sequencing

Elizaveta E. Lastochkina^1,2, Irina A. Lipko¹, Irina V. Tikhonova¹,
Andrey Yu. Krasnopeev¹, Sergey A. Potapov¹, Olga I. Belykh¹

¹Limnological Institute of SB RAS (Irkutsk, Russia)
²Irkutsk State University (Irkutsk, Russia)

Key words: Bacterioplankton; Lake Baikal; filterable forms of bacteria; high-throughput sequencing

Authors

Lastochkina Elizaveta E.

Irkutsk State University, Irkutsk, Russia; Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk, Russia

liza.lastochkina.00@mail.ru

ORCID - https://orcid.org/0000-0003-0094-5007

Lipko Irina A.